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腺相关病毒(AAV)2型转录组的全面RNA测序分析讲解
行业新闻 2018-12-28 15:43

  2016年,10x Genomics公司推出ChromiumTM系统,这是一套分子条形码和分析系统,由仪器、试剂盒和信息学软件组成,能全面对接Illumina测序仪。

  腺相关病毒( AAV )因其二进制生命周期而被识别,其有效复制依赖于与腺病毒( Ad )的共同感染,并且AAV潜伏期是在没有辅助病毒的情况下建立的。从潜伏期到Ad依赖性AAV复制的转变主要是在转录水平上调节的。目前的AAV转录本显示了当与Ad共同感染时发现的高度表达的转录本。到目前为止,AAV转录物仅在AAV单链DNA基因组的阳性链上被鉴定。假设AAV负链没有被转录。

  来自Charité医学院的研究人员,德国应用基于Illumina的RNA测序(RNA-Seq)在Ad存在或不存在的情况下表征整个AAV2转录组。他们发现已知和鉴定的新型AAV转录物,包括额外的剪接变体,其中最丰富的导致新的18-kDa Rep / VP融合蛋白的表达。此外,研究人员首次发现AAV负链上的转录在p5启动子上游具有聚集读数,通过cDNA末端的5'快速扩增和RNase保护测定证实。p5启动子在两个方向上显示出相当大的活​​性,这是发现转录不同的发现。在单独用AAV感染后,两种AAV链的低水平转录是可检测的并且在用Ad共感染时强烈刺激。

  新一代测序(NGS)允许对转录谱进行无偏的全基因组分析,此处用于在潜伏期和生产性感染期间对AAV2转录组进行深入分析。单细胞RNA-Seq测序分析导致发现新的AAV转录物和剪接变体,包括衍生的新型18-kDa Rep / VP融合蛋白。出乎意料的是,发现了来自AAV负链的转录,表明来自p5启动子的不同转录。这一发现为AAV延迟和高效复制之间切换的新概念打开了大门。在没有合适的动物模型来研究体内AAV的情况下,结合细胞和计算机研究将有助于推进对独特的二分AAV生命周期的理解。

腺相关病毒(AAV)2型转录组的全面RNA测序分析讲解

  RNA-Seq:AAV2基因组的两条链上的作图和转录分析。

  (A)AAV2特异性RNA-Seq的覆盖图谱在27hpi时读取AAV2 / Ad2-共感染细胞的AAV2基因组。AAV2基因组量表显示在中心。

  映射到正链的读数如上所示,映射到负链的读数如下所示。(B)如图A中所示。呈现27hpi的AAV2感染细胞的RNA-Seq读数。注意图A和B中读数计数的不同比例。(C)RNA-Seq读数的映射以poly(A)尾结束。相对于AAV2 / Ad2-共感染细胞的数据集中多腺苷酸化AAV读数的总和显示poly(A)添加的基因组位置。(D)反向AAV2 p5区的启动子活性。上部显示AAV2基因组,其具有p5,p19和p40启动子的转录起始位点的核苷酸位置(黑色箭头)。(E)AAV的5RACE分析减去链转录。显示来自AAV负链(核苷酸330至170)的克隆5RACE产物的DNA序列的TSS(箭头)。单个TSS在基因组上方显示为黑色方块。显示AAV正链上的第287位(灰色箭头)处的p5启动子TSS的取向。(F)用有义方向覆盖AAV2 170至250(左侧部分)或AAV2 170至340(右侧部分)的体外转录杂交探针进行RNase保护测定,以检测总AAV减去链转录物来自HeLa细胞的RNA模拟感染,AAV2感染,Ad2感染或AAV2 / Ad2共感染27小时。单个TSS在基因组上方显示为黑色方块。显示AAV正链上的第287位(灰色箭头)处的p5启动子TSS的取向。(F)用有义方向覆盖AAV2 170至250(左侧部分)或AAV2 170至340(右侧部分)的体外转录杂交探针进行RNase保护测定,以检测总AAV减去链转录物来自HeLa细胞的RNA模拟感染,AAV2感染,Ad2感染或AAV2 / Ad2共感染27小时。

  单个TSS在基因组上方显示为黑色方块。显示AAV正链上的第287位(灰色箭头)处的p5启动子TSS的取向。(F)用有义方向覆盖AAV2 170至250(左侧部分)或AAV2 170至340(右侧部分)的体外转录杂交探针进行RNase保护测定,以检测总AAV减去链转录物来自HeLa细胞的RNA模拟感染,AAV2感染,Ad2感染或AAV2 / Ad2共感染27小时。

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