新闻中心
行业新闻
单细胞悬液制备—杉米生物科技
行业新闻 2018-11-15 16:18

一、外周血样本
  

1. 单细胞悬液制备实验原理


  PBMC(peripheral blood mononuclear cell),外周血单个核细胞,其主要细胞类型为血液中具有单个核的细胞,主要包括淋巴细胞(T细胞、B细胞),单核细胞,吞噬细胞,树突状细胞和其他少量细胞类型。其中淋巴细胞占很大一部分。

  Ficoll是蔗糖的多聚体,呈中性,平均分子量为400,000,当密度为1.2g/ml仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大,离心后沉于管底;淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重,离心后漂浮于分层液的液面上,也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞,就可从外周血中分离到单个核细胞。
  

2.单细胞悬液制备实验材料


  全血 (以10ml为例)

  无菌PBS溶液(pH7.4) 或者生理盐水

  蔗糖溶液(Ficoll Pague PLUS) (GE Healthcare Life Sciences #17-1440-02)

  RPMI 1640培养基 (Invitrogen)

  胎牛血清(FBS)(GIBCO)

  双抗P/S (Penicillin/ Streptomycin) (GIBCO)

  二甲亚砜(DMSO)(SIGMA)

  预先装好异丙醇的冻存盒


单细胞悬液制备—杉米生物科技  

3.单细胞悬液制备操作步骤


  1.配制所需的溶液:

  a. 细胞培养基:RPMI 1640+10% FBS+1% P/S;

  b. 细胞冻存液:FBS中加入10%DMSO;

  2.将10ml全血转入50ml离心管中,加入10ml PBS溶液稀释,轻轻混匀;

  3.取两支15ml离心管,先加入5ml Ficoll溶液。然后将稀释的血液轻轻加到两支离心管的ficoll上层,一定要轻柔,避免两种溶液混合在一起,每只离心管各10ml稀释血液;

  4.2,000rpm,20min,注意,降速设置中一定要设置成no break,或者只有1-2成的制动。离心完毕将得到如图所示分层;

 
单细胞悬液制备—杉米生物科技
 


  5.PBMC所在细胞层为白色。此时可以用吸管将该层细胞吸取在另一干净的15ml离心管中。

  6.加入PBS至10-15ml,1,500rpm,10min离心后去掉上清,再加入培养基进行相同操作的清洗;

  7.加入5-10ml培养基重悬细胞,进行后续计数培养或者铺板;

  8.细胞冻存:将细胞离心收集之后,用细胞冻存液重悬。取1-1.5ml细胞至冻存管中,放入冻存盒(冻存盒可事先在4℃冰箱预冷)。再将冻存盒放置于-80℃冰箱过夜。第二天将细胞转入液氮中长期保存。

  备注:

  (1)全血溶液可以加在Ficoll上层或者下层,但是最终都必须保证两种溶液分层清晰。

  (2)分离PBMC第一步离心的时候,一定不能设置或设置低水平的制动。否则将分层混乱。

  二、脱落细胞样本

  在临床工作中,可以收集到大量自然脱落细胞,这些细胞标本经过简单处理,便可成为较好的单细胞悬液制备供流式细胞术分析。主要包括脱落细胞、胸腹水细胞、尿液、内镜刷检细胞等。

  (一)食管拉网细胞的单细胞悬液的制备

  1.将食管拉网器上的细胞洗脱到20ml PBS液中,以1500r/min离心后,再用PBS液洗2次,离心500~800r/min,1~2min,弃上清;

  2.再加入PBS液5ml,以300目尼龙滤网过滤,离心沉淀去上清;

  3.加少许PBS液混匀沉淀细胞,加固定液或低温保存,备用。

  (二)尿液脱落细胞的单细胞悬液的制备

  1.用以清洁器皿收集24h尿液,置4℃冰箱中自然沉淀2h,轻轻倒去上清液,留下少许带细胞的沉淀物,用吸管移至10~20ml离心管中;

  2.500r/min离心10min,去上清;

  3.加PBS液8~10ml,以1000r/min离心10min,去上清,重复再洗1次;

  4.再加5ml PBS液混匀,用300目尼龙滤网过滤,离心沉淀去上清;

  5.再加少许PBS液,混匀。加固定液或低温保存,备用。


单细胞悬液制备—杉米生物科技

  (三)胸、腹水脱落细胞的制备

  1.抽取胸、腹水50~100ml,加入1000U/ml肝素液1ml,放盐水瓶中置于4℃冰箱中静置6~12h,弃去上清;

  2.将底部10~20ml用长吸管移入试管中,用PBS液洗3次,以1500r/min离心沉淀5min;

  3.再加5ml PBS液混匀,用300目尼龙滤网过滤,离心沉淀去上清;

  4.加少许PBS液,混匀;加固定液或低温保存,备用。

  (四)冲洗液细胞样品的制备

  1.用300~500ml生理盐水冲洗膀胱,冲洗一定时间后,吸出冲洗液放入容器中于冰箱内置6~12h;

  2.取沉淀液20~40ml,离心沉淀并以生理盐水洗2次,吸上清;

  3.加10ml PBS液,混匀,以300目尼龙滤网过滤,离心沉淀去上清;

  4.过滤后1000r/min,10min,离心沉淀,去上清;加固定液或低温保存备用。