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实体组织制备温和组织处理器
行业新闻 2018-11-19 17:02
  流式细胞术作为一种可在单细胞水平上对大量细胞进行快速、准确、多参数定量分析和分选的高技术,在细胞生物学、免疫学、肿瘤学等方面的应用日趋广泛和深入。进行流式细胞术分析的前提是样品为单细胞悬液,根据不同实体组织成分的特点可选择不同的分散细胞的方法,以期达到单细胞产量高、细胞损伤小的目的。

       在实体组织分散为单细胞的过程中,解离的方法有可能瞬间或持久地影响细胞的性质,比如,形态上显而易见的细胞膜破损,细胞表面上可出现泡状特征,还有一些是难以观察到的线粒体活性的变化、选择性膜表面抗原的丢失、蛋白质的丢失等,细胞受损程度受温度、pH值、处理时间等多种因素的影响。机械性或人工制备的单细胞,在某些性质上很可能已改变了原组织细胞特性,因此处理不同组织时,努力摸索方法,尽可能采用对细胞损伤小,产率较高的单细胞悬液制备方法,最大限度地保持细胞原有特性。

       目前将组织分离为单个细胞的传统方法有机械法、酶消化法和化学法等,这些方法没有统一的标准,且非常浪费时间,获得的细胞的活性和得率相对低很多,美天旎研发的gentleMACS组织处理系统结合机械法和酶消化法,使用自动化方式可以快速温和、安全、省时、标准化、便捷、自动化的从组织(脾脏,肝脏,肺部,肿瘤,表皮,神经组织....)中分离单个细胞悬液,也可将组织块制备成匀浆(如蛋白提取,核酸提取)。下面介绍几种
温和组织处理器方法。

温和组织处理器

  (一)酶消化法

  酶的作用原理主要有三方面:一是破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等,二是水解组织细胞的紧密连接结构的蛋白质,三是水解组织粘多糖物质。酶消化法是实体组织分散为单细胞的主要方法之一。常用的酶类有:胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、溶菌酶、弹性蛋白酶等。可根据分散的组织类型确定使用的酶类。需要注意的是使用条件和影响因素(酶浓度、酶效价、作用时间、pH值)等,如胃蛋白酶在碱性环境下失去活性,胰酶在中性溶液中活性欠佳。

  酶消化法常规程序如下:

  1、将适合于酶消化的组织置于离心管中。

  2、将选好的酶溶液1~2ml加入盛有被消化组织的试管中。

  3、常规消化20~30min(恒温37℃或室温),消化期间间断振荡或吹打。

  4、终止消化,收集细胞悬液,以300目尼龙网过滤,除去细胞,以低速离心除去细胞碎片。

  5、加入PBS 2ml充分混匀,离心弃掉上清。再加入0.5ml PBS重悬细胞。

  6、将制备好的单细胞悬液进行荧光标记后上机检测或保存备用。


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  (二)机械法

  机械法分散实体组织包括:用剪刀剪碎组织或用锋利的解剖刀剁碎组织,用匀浆器匀浆,用线注射针头反复抽吸细胞等,最后用300目尼龙网过滤细胞得到
温和组织处理器

  1、剪碎法

  (1)将组织块放入平皿中,加入少量生理盐水。

  (2)用剪刀将组织剪至匀浆状。

  (3)加入10ml生理盐水。

  (4)用吸管吸取组织匀浆,先以100目尼龙网过滤到试管内。

  (5)离心沉淀1000rpm/min,4~5min,再用生理盐水洗3次,每次以短时低速(500~800rpm/min)离心沉淀去除细胞碎片。

  (6)以300目尼龙网过滤去除细胞。

  (7)选择适当的固定液(70%冰乙醇等)固定细胞或低温保存备用。

  2、网搓法

  (1)将100目、300目尼龙网扎在小烧杯上。

  (2)把剪碎的组织放在网上,用眼科镊子轻轻搓组织块,边搓边用生理盐水冲洗,直到将组织搓完。

  (3)收集细胞悬液,离心沉淀细胞500~800rpm/min,2分钟。

  (4)固定细胞或低温保存备用
温和组织处理器

  3、研磨法

  (1)先将组织剪碎成1~2mm3小块。

  (2)放入组织研磨器中加入1~2ml生理盐水。

  (3)转动研棒,研至匀浆。

  (4)加入10ml生理盐水,冲洗研磨器。

  (5)收集细胞悬液,并经300目尼龙网过滤,离心沉淀细胞,500~800rpm/min,2分钟,再用生理盐水洗3遍,离心沉淀。

  (6)固定或低温保存细胞,备用。


温和组织处理器

  (三)化学处理法

  化学处理法的主要原理是:将组织细胞间起粘连作用的钙、镁离子置换出来,从而使细胞分散下来。

  1、
温和组织处理器试剂配制

  (1)0.2%EDTA配制:将0.2gEDTA溶解于100ml Hank液中,封装高压消毒,置0~4℃保存。

  (2)胰酶加EDTA配制:胰酶0.25g加PBS(pH7.0)200ml,浓度为0.125%,EDTA0.2g加PBS(pH7.0)100ml,浓度为0.2%。各取40ml混合,分装后置0~4℃冰箱保存,使用前过滤即可使用。

  2、实验方法

  (1)将组织切成薄片,置于试管。

  (2)首先加入EDTA液5ml,室温下0.5小时,离心弃之。

  (3)加入胰酶-EDTA液5~10ml,置37℃恒温水浴30min,间断振荡3~5次。

  (4)用300目尼龙网过滤,离心沉淀1000rpm/min,5分钟。再以生理盐水洗2~3次,离心500~800rpm,1~2分钟。

  (5)将细胞固定或低温保存备用
温和组织处理器

  化学处理法获得的细胞存活率低,细胞产量较低,细胞碎片和细胞聚集量不稳定。


温和组织处理器

  (四)美天旎组织解离系统

  1、使用方法:将20~4000mg大小样本或0.3~10ml样本与组织所对应得解离试剂盒共同加入至组织解离管并旋紧管盖;把解离管安装至gentleMACS温和组织处理器上,启动程序并运行,最终得到
温和组织处理器或亚细胞结构。

  2、适用组织:

  (1) 制备
温和组织处理器

  • 人类或小鼠的肿瘤组织

  • 小鼠或大鼠的新生心脏组织

  • 神经组织

  • 小鼠的脾脏,肺,固有膜,肌肉,上皮组织,肝脏

  • 人类或小鼠的皮肤等

  (2)制备组织匀浆

  • 从新鲜或冻存样本中提取DNA,RNA

  • 提取蛋白

  • 分离细胞器

  • 测定病原菌滴度等

  3、产品特点

  (1)温和有效:

  gentleMACS使用专门的一次性分离管(C管和M管),管盖上带有特殊设计的转子和定子,对样本减少损伤,保证了细胞活性,同时得到了高回收率。

  (2)一个机器支持多种用途:

  生成
温和组织处理器和制备亚细胞物质。C管可以得到单细胞悬液,用于细胞分选,分析或者是培养。M管可以将组织和细胞匀浆,用于分离亚细胞物质(如蛋白,核酸)。

  (3)无菌分离:

  C管和M管的中心都有一个用隔膜封闭的小孔,能保证在无菌条件下,在封闭系统中安全地处理样品。

  (4)用户安全:

  针对一些感染性样本处理采用封闭系统处理,比如细菌病原感染的样本,完全不需要打开试管盖,即可添加酶以及其他溶液,或者取出分离出来的细胞或者匀浆溶液,保护实验室操作人员安全。

  (5)全自动和标准化:

  自动标准化程序已经设置好时间,速度和操作方向,只要将样本材料和适合的溶液(如缓冲液,培养基等等)加入试管内,把试管头朝下安装即可运行程序。

  (6)结果可靠:

  标准化流程操作,减少人为操作误差,使结果有高度可重复性。

  (7)便捷灵活:

  超净台上即可操作,方便安装。仪器样本容量灵活(0.3~10ml),标本大小20~4000mg。